Chap.3 A Logical Model of CisRegulatoryControl in a Eukaryotic System

Introduction

• Development시에 시간/공간적인 Gene Expression의 차이에 따라 Morphological Form과 Cell Function이 서로 다르게 Organized된다.
• 이러한 시간/공간적인 Gene Expression의 차이를 가질 수 있도록 하는 것이 Gene Regulatory System이다.

  • trans-regulatory system : Gene Regulatory System 에서 해당 State를 구현하는 데 필요한 TranscriptionFactor들의 집합. 즉 DNA Binding Proteins

  • cis-regulatory system : trans-regulatory system의 구성원들이 작용을 할 수 있도록 하는 DNA sequence상의 target site들의 집합.

Modeling Consideration

The Problem

• 직접적으로 데이터를 측정할 수 있도록 amenable한 목표 시스템을 설정하여야 함.
  • 모델 생물의 결정

  • 모델 cis-regulatory system의 결정

Sea Urchin Development

• Sea Urchin의 특성 (모델생물로의 적합성)

  • 72hr 에서 1500개 정도의 cell을 지니며 embryonic growth를 완료함. => cell 개수가 적지 않음

  • 상대적으로 maternal assymetries 가 differentiated cell function 으로 전환되는 경우가 적음 (?)
  • The rate of embryonic development is temperature dependent. (faster when it is warmer)

  • Fig 3.2 : a. uncleaved egg -> c. sixth cleavage -> d. blastula(24hr) -> e. midgastula(36hr) -> f. prism(60hr) -> g. pluteus larva(72hr)

The Endo16 gene

• cell의 surface에서 발견되는 polyfunctional glycoprotein을 encode하고 있음
• macromere에서 파생된 cell에서 발현
• earliest expression :

  • 8~9 cleavage (18~20hr : c와 d 사이) - stereotyped & syncronized cell div.

  • induced by micromeres
• 상당히 이른 시기에 Endo16 이 txn(transcription)을 일으킴

  • => 그다지 많지않은 cis-regulatory factor가 관여할 것으로 예상됨. ; maternal assymetry에서 상대적으로 자유로움. (Fig 3.3에서의 txnal symmetry참조)

• late expression :
  • midgut(중배)에서는 txn이 증가, 그 이외의 곳에서는 repression이 일어남

    • => 시간에 따른 다양한 발현관련 양상을 볼 수 있음

• 이와같은 특징들때문에 모델 유전자로 채택함.

• Endo16의 cis-regulatory system 은 2300bp upstream에서 시작됨 (Fig 3.4)

• Target site는 poly(dI-dC)/poly(dI-dC)를 이용하여 mapping : DnaMethyltransferase 참조

• expression level control은 primarily transcriptional함.

Modeling Framework

• Endo16의 cis-regulatory system 전체 모듈 구성 : G, F, E, DC, B, A 의 6가지 모듈과 Bp(Basal Promoter)

• A 모듈이 다른 5개 모듈을 mediate함

Experimental Procedure and Data Processing

• Expression Construct
  • restriction fragment를 [Polylinker] 혹은 earlier generation of vectors를 이용하여 insert 하여 만듦
  • Otx mutation site를 집어넣는 경우 PCR 등을 이용.
    • GBA(OTXm)-BpCAT = GBA(OTXm_L.Xba_L) + (Xba_R.OTXm_R)A + Bluescript CAT

  • Q - PrimerSynthesis : OutsidePrimer InsidePrimer BluescriptVector

• CAT Enzyme Activity Measure
  • 100개의 embryo lysate 사용
  • Conc. Measure : by [Chromatography]
  • Large error bar : replicate sample 간의 variation 때문임. 이는 나중에 discuss (p83)
• Data Preparation
  • measure time : 10, 20, 30, 48, 72 (respectively initial, early expression, d-e, e-f, development complete)
  • 100 embryo에 대한 average 를 한 점으로 표시
  • 이 실험에서는 한 세포당의 절대적인 양보다는 한 개체 전체에서의 발현패턴이 중요하므로, experimental batch 단위 즉 1회 실험분 값으로 상대적인 양을 그래프화함 (per embryo)
  • Fig 3.9(B)와 같이 한 세포당 절대발현량이 중요한 경우는 3.9(A)에 나온 cell 개수에 따라 normalize해서 사용할 수 있음 (per cell)

Model of Endo16 Regulatory Functions

Modular interaction

Module A 는 혼자서도 Endo16을 발현시킬 수 있다.

• A만 있으면 초반의 발현은 문제 없음 : Fig 3.7(A,B)
• Fig 3.9 (B) : GFEDCBA-Bp와 A-Bp와의 초반 그래프는 차이가 없음. 반면 B-Bp의 경우 초기의 발현이 많이 되지 않음

다른 모듈은 A에 의해 Activity가 mediate된다.

• B와 G만을 가지고 생성한 Expression Construct는 상대적으로 매우 낮은 expression
• A, B 모듈 만으로도 전체 모듈일때와 비슷한 레벨로 발현됨

  => 위 두 사실로 A가 B(or G)의 activity를 boost up 해줌(혹은 역)을 알 수 있음

• Fig 3.9 (B)
  • A-Bp와 GFEDCBA-Bp는 초반에 비슷
  • B-Bp와 GFEDCBA-Bp는 후반에 슬로프 패턴이 비슷

• F, E, DC 는 Endo16이 발현하지 않는 cell에 많이 분포함 => repression Factor로 의심.

• 초반에 A만 작용하다가 45hr 전후로 B모듈에 의해 up-regulation되는 것임.
• FEDC의 작용에도 A가 필요함 (이후에 설명됨)
• 이와같이 전반적인 enhance, repress를 A가 mediate함.

G,B 모듈은 A와 작용하여 4x amplify

• G는 B와 같은 역할을 하지만 부수적인 요소임
• B는 later development의 주요소 역할을 수행함
• Fig3.11(A),3.12(C) B는 A와 연결시에 enhance 효과가 크다
• B와 A의 관계가 Simple linear함 ( BA = 4.2 x B ) : Fig3.11(A)

F,E,DC는 Endo16의 발현을 shut off하는 기능을 수행 (Repress)

• F, E : vegetal plate
• DC : skelectogenic cell
• 위와 같이 Endo16 발현이 되어선 안될 곳에서 억제역할을 수행함.

• LiCl Treatment

  • F, E, DC의 효과를 억제함. 즉 repression effect 해제

  • Fig 3.13 : LiCl treat/untreat

    • Treat/Untreat값이 클수록 해당 construct에서 F가 기능을 한다는 이야기임. (그 비의 차이만큼 F가 억제하고 있다는 뜻이므로)
    • GFBA : F가 작동
    • FA : F가 작동
    • FB : F가 작동안함
    • GF : F가 별로 작동안함
    • CA : F의 일부인 C만으로도 repression mechanism 작동
      • 여기에서 C는 CREB Protein의 Binding site로 F 위에 존재함
    • COtxZ : A의 일부인 Otx와 Z만으로 작동
    • C-Otx(Z) : Z를 mutation시 C가 작동 안함. 즉 C와 Z가 interaction.

    ==> 결론 : F (이중 C) 는 A (이중 Z) 와 함께 Repression Effect를 관장한다.

Interaction with Module A Element

G,B 모듈은 A 모듈의 P 와 CG1을 필요로 한다.

• Fig 3.11(B~D) : P,CG1이 A와 B를 linking하는 부위임을 알 수 있다.

P&CG1은 G,B의 스위치

Otx는 B,G가 작동을 안할때 A모듈의 Activity를 좌우한다

• Fig 3.12
  • (A) : Otx만으로도 A의 초반 기능을 수행할 수 있음
  • (B) : OtxZ만으로 A의 모양을 한 커브가 생성.
  • (C) : BA construct 에서는 Otx가 관여 안함 (별 차이 없음)

F, E, DC는 A 모듈의 Z와 Repressive role을 수행한다

• Fig 3.13 :F는 Z와 상호작용함. (E, DC도 마찬가지임)

• CG2의 자리와 Z의 자리가 Overlap => competitive binding

CG2, CG3, CG4 는 전체 txn rate를 2배로 boost up!

• CG3,4가 없으면 전체적으로 발현량이 절반으로 줄어듬
• B와는 연관이 없음
• CG2와 CG3,4가 interaction
• Endo16의 모둔 Regulatory Path에 영향을 미침

Implications of the Endo16 cis-Regulatory Model

• 위의 사실들을 식으로 표현함
• A-F, cg, p, otx 의 모든 값들은 0과 1 사이의 값을 지님

Conclusions

This network is to be considered not only a collection of genes, but also a network of linked regulatory devices that specify the operational logic of embryonic development.